Παρακάτω μπορείτε να διαβάσετε ορισμένα πράγματα για την τεχνική της PCR καθώς και να δείτε σχετικά βίντεο για την καλύτερη κατανόηση αυτής. Επιπλέον, παρατίθεται και ένα link από το Πανεπιστήμιο της Γιούτα για να πειραματιστείτε σε ένα εικονικό εργαστήριο!

Η PCR είναι μια πολύ γρήγορη και οικονομική τεχνική που χρησιμοποιείται για να πολλαπλασιάσει με ακρίβεια μικρά τμήματα του DNA. Κάτι τέτοιο είναι απαραίτητο γιατί για να γίνει ανάλυση των μεταλλάξεων ή των πολυμορφισμών σε μοριακό επίπεδο, είναι απαραίτητες αρκετά μεγάλες ποσότητες του DNA. Aπομονωμένα τμήματα DNA θα ήταν αδύνατο να μελετηθούν επαρκώς χωρίς την μέθοδο της PCR.

Για τον πολλαπλασιασμό ενός τμήματος DNA χρησιμοποιώντας την PCR, το δείγμα του DNA αρχικά θερμαίνεται έτσι ώστε να αποδιαταχθεί το δίκλωνο DNA και να διαχωριστεί σε δυο μονόκλωνα τμήματα. Στη συνέχεια ένα ένζυμο, το οποίο λέγεται πολυμεράση TAQ, συνθέτει δυο συμπληρωματικούς κλώνους DNA χρησιμοποιώντας τους αρχικούς κλώνους ως πρότυπα (μήτρες). Αυτή η διαδικασία καταλήγει στον πολλαπλασιασμό του DNA, με κάθε ένα από τα καινούργια μόρια να περιέχει έναν παλιό και έναν καινούργιο κλώνο DNA. Ο κύκλος αυτός αποδιάταξης και σύνθεσης νέου DNA μπορεί να επαναληφθεί πολλές φορές, συνήθως 30 ή 40, καταλήγοντας στο σχηματισμό περισσότερων από 1 δισεκατομμύριο ακριβών αντιγράφων του αρχικού τμήματος του DNA. Το υπόλοιπο γονιδίωμα δεν πολλαπλασιάζεται, και έτσι δεν ανιχνεύεται με τις μοριακές τεχνικές.

Σήμερα, η όλη διαδικασία της PCR έχει αυτοματοποιηθεί και με τα καινούργια και τελειότερα μηχανήματα μπορεί να τελειώσει σε λίγες μόνο ώρες. Η όλη διαδικασία των κύκλων της θέρμανσης και της μείωσης της θερμοκρασίας προγραμματίζεται από ένα μηχάνημα το οποίο ονομάζεται θερμικός κυκλοποιητής (PCR thermal cycler) και το οποίο έχει τη δυνατότητα να αυξομειώνει την θερμοκρασία της αντίδρασης κάθε λίγα λεπτά ή δευτερόλεπτα, έτσι ώστε να επιτρέψει τη σύνθεση νέων τμημάτων DNA. Επίσης, είναι πολύ σημαντικό να έχουν καθοριστεί επακριβώς από τον ερευνητή οι χημικές συνθήκες υπό τις οποίες θα γίνει ο πολλαπλασιασμός του DNA, καθώς και να έχει γίνει η σύνθεση των ολιγονουκλεοτιδίων που θα ξεκινήσουν την αντίδραση (εκκινητές ή DNA primers) τα οποία πρέπει να έχουν έτσι σχεδιαστεί ώστε να είναι απόλυτα συμπληρωματικά στα άκρα των γονιδιακών τόπων που μας ενδιαφέρουν.

Από τη στιγμή που θα πολλαπλασιαστούν τα τμήματα του DNA, μπορούν να αναλυθούν με πολλές εργαστηριακές τεχνικές. Για παράδειγμα, οι περισσότερες τεχνικές της χαρτογράφησης του DNA που χρησιμοποιούνται στην αποκωδικοποίηση του ανθρώπινου γονιδιώματος (Human Genome Project) στηρίζονται πάνω στην τεχνική PCR. Επίσης, η PCR είναι πολύ χρήσιμη σε πολλές καινούργιες μεθόδους, όπως το DNA FingerPrinting, η διάγνωση βακτηριδίων και ιών και η διάγνωση γενετικών ανωμαλιών. Η δύναμη της PCR είναι τέτοια που είναι δυνατόν να γίνει ανάλυση από το γενετικό υλικό ενός και μόνο κυττάρου.

Μετά την πρώτη ανακοίνωση για την PCR, η τεχνική διαδόθηκε στην επιστημονική κοινότητα με την ταχύτητα αλυσιδωτής αντίδρασης. Καθώς όλο και περισσότεροι επιστήμονες ήρθαν σε επαφή με την PCR, εισήγαγαν μετατροπές της μεθόδου και χρησιμοποίησαν την τεχνική σε νέες ασθένειες και με νέους τρόπους. Σε πολύ μικρό χρονικό διάστημα η PCR έγινε μια τεχνική ρουτίνας για την έρευνα και ακολούθησαν και οι πρακτικές της εφαρμογές.

Μια ασθένεια της οποίας η ανίχνευση απλοποιήθηκε εξαιρετικά με την χρήση της PCR είναι η μυϊκή δυστροφία του Duchenne (Duchenne muscular dystrophy-DMD). Το ανθρώπινο γονίδιο για την DMD απλώνεται σε πάνω από 2.000.000 ζευγάρια βάσεων DNA στο χρωμόσωμα X και είναι ένα από τα μεγαλύτερα γονίδια που έχουν βρεθεί μέχρι σήμερα. Τα αγόρια που πάσχουν από μυϊκή δυστροφία του Duchenne έχουν ελλείμματα στα εξόνια του γονιδίου. Το τεράστιο μέγεθος του γονιδίου κάνει πολύ δύσκολη και μη πρακτική την εξέταση όλου του μήκους για μεταλλάξεις με τις συνηθισμένες μεθόδους. Σήμερα υπάρχει μια παραλλαγή της PCR η οποία ονομάζεται «multiplex PCR» η οποία χρησιμοποιείται έτσι ώστε να ερευνήσουμε διαφορετικούς γονιδιακούς τόπους από το ένα ως το άλλο άκρο του γονιδίου. Γίνεται ταυτόγχρονος πολλαπλασιασμός, με 9 διαφορετικά σετ εκκινητών, όλα μέσα στον ίδιο δοκιμαστικό σωλήνα. Το κάθε προϊόν του πολλαπλασιασμού παράγει ένα τμήμα διαφορετικού μεγέθους και έτσι μετά τον πολλαπλασιασμό τα προϊόντα της PCR μπορούν να αναλυθούν με ηλεκτροφόρηση. Τα αγόρια τα οποία έχουν φυσιολογικό το γονίδιο της δυστροφίνης θα δείχνουν 9 προϊόντα του πολλαπλασιασμού τα οποία θα είναι διαφορετικού και συγκεκριμένου μεγέθους. Ενώ τα αγόρια που θα έχουν μεταλλάξεις στο γονίδιο θα λείπει ένα ή περισσότερα προϊόντα της PCR ή τα προϊόντα της PCR θα είναι μικρότερου μεγέθους.

Η PCR μπορεί επίσης να χρησιμοποιηθεί για την ανίχνευση γενετικού υλικού ενός μικροοργανισμού που έχει προσβάλλει τον άνθρωπο. Τα συνηθισμένα τεστ που χρησιμοποιούνται όπως η καλλιέργεια των μικροοργανισμών ή την χρήση αντισωμάτων μπορεί να δώσουν αποτελέσματα ή είναι ιδιαίτερα περίπλοκα. Η μέθοδος της PCR είναι μια γρήγορη και πολύ απλή εναλλακτική λύση. Παράδειγμα αποτελεί η περίπτωση εφαρμογής της για την διάγνωση του ιού του AIDS. Η PCR μπορεί να χρησιμοποιηθεί για να ανιχνεύσει το μικρό ποσοστό των κυττάρων τα οποία έχουν μολυνθεί με τον ιό HIV. Έτσι μετά τον ειδικό πολλαπλασιασμό του γονιδιακού τόπου του HIV και ηλεκτροφόρηση, η παρουσία ενός προϊόντος της PCR του σωστού μεγέθους σηματοδοτεί την παρουσία της αλληλουχίας του HIV και συνεπώς την μόλυνση από HIV. Η ανιχνευτική ικανότητα της PCR είναι τόσο μεγάλη που μπορούμε να πάρουμε αποτέλεσμα ακόμα και από δείγματα DNA τα οποία έχουν σχεδόν καταστραφεί και πολύ συχνά και από ένα μόνο κύτταρο. Σήμερα έχουμε ήδη χρησιμοποιήσει την PCR με τον πολλαπλασιασμό DNA από μερικές ασυνήθιστες πηγές όπως ζώα τα οποία έχουν πια εξαφανιστεί, από Αιγυπτιακές μούμιες, από ένα τερμίτη 3.000.000 ετών ο οποίος είχε φυλακιστεί μέσα σε ήλεκτρο. Η ανακάλυψη της PCR μεταμόρφωσε ουσιαστικά μέσα σε μια νύχτα ολόκληρες μουσειακές συλλογές βιολογικών ευρημάτων μέσα σε θησαυρούς γενετικής πληροφορίας για την εξέλιξη, εξαφάνιση και σημερινή πορεία των ειδών. Οι εξελικτικοί βιολόγοι χρησιμοποιούν αυτά τα δείγματα και την μέθοδο της PCR για να διερευνήσουν τις γενετικές διασυνδέσεις στον οργανισμό μεταξύ διαφόρων ειδών τώρα και στο παρελθόν. (Πηγή)

PCR technique (Polymerase Chain Reaction), Animation.

Virtual Lab from University of Utah